產(chǎn)品中心
產(chǎn)品詳情

  • 產(chǎn)品名稱： Pfu DNA Polymerase(含預(yù)混Mg2+的10×Pfu Buffer)

  • 產(chǎn)品型號： 500 U, 2.5 U/ul
  • 產(chǎn)品廠商：通蔚生物
  • 產(chǎn)品價格：322
  • 產(chǎn)品庫存：117
  • 產(chǎn)品文檔：
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簡單介紹：
Pfu DNA Polymerase(含預(yù)混Mg2+的10×Pfu Buffer)該酶無 5’→3’核酸外切酶活性，PCR 反應(yīng)中的延伸速度一般為0.5-1kb/min，比 Taq DNA Ploymerase 要低。該酶熱穩(wěn)定性更好，95℃1 小時仍保持90%以上的活性，對于 GC 含量很高的模板，變性溫度可以提高到98℃而不影響其活性。使用該酶進行 PCR 擴增得到的產(chǎn)物為平末端，不能直接用 TA 載體克隆。
詳情介紹：
產(chǎn)品特點
Pfu DNA Ploymerase 是從克隆有 Pyrococcus furiosis DNA Ploymerase 基因的大腸桿菌中表達并經(jīng)過柱純化分離出來的重組蛋白，其分子量為 90kD。該酶具有3’→5’核酸外切酶活性，能糾正 DNA 擴增過程中產(chǎn)生的錯配，是目前已發(fā)現(xiàn)的所有耐熱DNAPolymerase中出錯率低的。
該酶無 5’→3’核酸外切酶活性，PCR 反應(yīng)中的延伸速度一般為0.5-1kb/min，比 Taq DNA Ploymerase 要低。該酶熱穩(wěn)定性更好，95℃1 小時仍保持90%以上的活性，對于 GC 含量很高的模板，變性溫度可以提高到98℃而不影響其活性。使用該酶進行 PCR 擴增得到的產(chǎn)物為平末端，不能直接用 TA 載體克隆。

成分規(guī)格

產(chǎn)品組成

規(guī)格

Pfu DNA Polymerase

250Ｕ/ 2.5U/μl

10 × Taq Plus Buffer（含 Mg2+）

1m / 2*1 ml

-20℃，有效期 1 年

本產(chǎn)品僅供科研使用　，不得用于其它用途


使用方法
（注 意：以下舉例為常規(guī)PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，實際操作中應(yīng)根據(jù)模板、引物結(jié)構(gòu)和目的片段大小不同進行相應(yīng)的調(diào)整和優(yōu)化）
1. PCR 體系：
推薦體系（50μl）

產(chǎn)品組成

規(guī)格

Pfu DNA Polymerase

250Ｕ/ 2.5U/μl

10 × Taq Plus Buffer（含 Mg2+）

1m / 2*1 ml

-20℃，有效期 1 年

本產(chǎn)品僅供科研使用　，不得用于其它用途


注 意：
A 引物濃度請以終濃度 0.1-1.0μM 作為設(shè)定范圍的參考。擴增效率不高的情況下，可   提高引物的濃度；發(fā)生非特異性反應(yīng)時，可降低引物濃度，由此優(yōu)化反應(yīng)體系。
B 鎂離子濃度請以終濃度 1.5-3mM 作為設(shè)定范圍的參考。可根據(jù)不同的引物對和模板  來調(diào)節(jié)鎂離子濃度，由此優(yōu)化反應(yīng)體系）
 
2. PCR 程序

過程

溫度

時間

預(yù)變性

94℃

5min

25－35cycles

變性

94℃

30sec

退火

55－65℃

30sec

延伸

72℃

1kb/60sec

終延伸

72℃

5min


注 意：
Ａ 一般實驗中退火溫度比擴增引物的熔解溫度 Tm 低 5℃，無法得到理想的擴增效率時，適當(dāng)降低退火溫度；發(fā)生非特異性反應(yīng)時，提高退火溫度，由此優(yōu)化反應(yīng)條件。
b 延伸時間應(yīng)根據(jù)所擴增片段大小設(shè)定，Taq DNA Polymerase的擴增效率為 1 kb/60 sec。
C 可根據(jù)擴增產(chǎn)物的下游應(yīng)用設(shè)定循環(huán)數(shù)。如果循環(huán)次數(shù)太少，擴增量不足；如果循環(huán)次數(shù)太多，錯配機率會增加，非特異性背景嚴重。所以，在保證產(chǎn)物得率的前提下，應(yīng)盡量減少循環(huán)次數(shù)）
3. 結(jié)果檢測：
反應(yīng)結(jié)束后取 5 μl 反應(yīng)產(chǎn)物，加入適量上樣緩沖液后進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。
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